Photometrische Bestimmung von D-Glucose

Spezial/Multiwellenlängen-Methode mit
WTW photoLab® UV-VIS Spektralphotometern

Photometrische Bestimmung von D-Glucose:

Inhaltsverzeichnis:

Inhalt dieser Dokumentation

• Teil 1: Allgemeine Beschreibung
• Teil 2: Analysenvorschrift
• Teil 3: Methodenparameter; Formeldesign
• Teil 4: Programmierung der Methode

Teil 1: Allgemeine Beschreibung

Bei der enzymatischen Umsetzung von D-Glucose zu D-Gluconat-6-Phosphat wird eine äquivalente Menge des Oxidationsmittels Nicotionamid-Adenin-Dinucleotid / Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NAD+/NADP+) zu NADH/NADPH reduziert. NADH/NADPH besitzt bei 340 nm eine spezifische Absorption und kann photometrisch bestimmt werden.

Abbildung 1: Extinktionsspektrum NAD+/NADP+ und NADH/NADPH.

Teil 2: Analysenvorschrift

Durchführung der Bestimmung Glucose aus Disacchariden wird nur nach vorherigem Aufschluss erfasst.
Probe	Photometer
In eine leere 10 mm Rechteckküvette werden gegeben:	Auswahl Multi-Wellenlängen Methode: Glc(f) 716 251, 10 mm
1,000 ml  - Reagenz 1, NADP und ATP + 0,100 ml  - Probe +1,900 ml  - bidest. Wasser mischen 3 min. - Reaktionszeit	Dilution Verdünnungsfaktor einstellen. Der Verdünnungsfaktor multipliziert das Ergebnis mit dem hier eingestellten Zahlenwert.
1. Extinktionsmessung Glc(f) + NADP/ATP Messung der D-Glucose nach Zugabe von Reagenz 1, Probe und bidestilliertem Wasser	Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.   Nach der Messung die Küvette mit der Analysenlösung zur Weiterbearbeitung aus dem Küvettenschacht nehmen.
In dieselbe Küvette werden gegeben: + 0,020 ml Reagenz 2, G6P-DH und HK mischen 10 - 15 min. Reaktionszeit
2. Extinktionsmessung Glc(f) + HK/G6P-DH Messung der D-Glucose nach Zugabe von Reagenz 2	Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.   Nach der Messung Küvette aus dem Küvettenschacht nehmen.
Weiter mit: „Leerwert - Bestimmung“
Leerwert	Photometer
In eine leere 10 mm Rechteckküvette werden gegeben: 1,000 ml Reagenz 1, NADP und ATP +2,000 ml bidest. Wasser mischen 3 min. Reaktionszeit
3. Extinktionsmessung BV + NADP/ATP Messung des Leerwertes nach Zugabe von Reagenz 1 und bidestilliertem Wasser	Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.   Nach der Messung die Küvette mit der Analysenlösung zur Weiterbearbeitung aus dem Küvettenschacht nehmen.
In dieselbe Küvette werden gegeben: + 0,020 ml Reagenz 2, G6P-DH und HK mischen 10 - 15 min. Reaktionszeit
4. Extinktionsmessung BV + HK/G6P-DH Messung des Leerwertes nach Zugabe von Reagenz 2	Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.
Das Ergebnis wird angezeigt

Teil 3: Methodenparameter und Formeldesign

Konzentrationsberechnung:

Hierbei gilt: 

Potometrischer Faktor (F) und Messbereich:

Rechteckküvette 10 mm bei 340 nm
F = 0,864
Messbereich: 0,08 – 0,5 g/L Glucose

Formeldesign:

Die Reihenfolge der Extinktionsmessungen folgt dem Schema des Test-Herstellers.

Die Reihenfolge der Messungen der Formel-Variablen innerhalb der Photometer Programmierung folgt dem Index der Formel-Variablen in aufsteigender Richtung.

Für die Anordnung der Formel-Variablen im Ablauf Schema der praktischen Durchführung gibt es verschiedene Möglichkeiten. In dieser Dokumentation wird davon lediglich eine Variante berücksichtigt.

Glukose Berechnung
Extinktionsdifferenzen

ΔEGlc = (E2_Glc – E1_Glc) – (E2_Leerwert – E1_Leerwert)

Hierbei gilt:

Für die Berechnung der Extinktionsdifferenzen und Berücksichtigung des photometrischen Faktors sowie einer möglichen Messbereichserweiterung durch Vorverdünnung kann die erweiterte Formel für die Programmierung des Photometers folgendermaßen aussehen:

R = 0,864 * ((A_{340nm_2} - A_340nm) – (A_{340nm_4} + A_{340nm_3})) * K₁

Hierbei gilt:

Teil 4: Programmierung der Methode

Bei der manuellen Eingabe der Programmdaten für eine neue Methode zur Bestimmung von Glucose, folgende Werte einstellen:

* Einstellungen und Beschriftungen sind frei wählbar; Anzahl der Zeichen ist begrenzt.
** Das Dezimaltrennzeichen bei der Zahleneingabe ist der Punkt ‚.‘

Hier den ganzen Artikel als PDF zum Download: